中华人民共和国卫生部9月9日，《全国肾综合征出血热监测方案（试行）》印发

附件7 交叉保护中和实验

试验目的：血清分型

标本：出血热恢复期病人血清

材料：

1. 毒株：汉滩病毒标准株 76－118，汉城病毒标准株 Seoul。

2. 标准血清:兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清。

3. 空斑减少中和试验常用试剂。

步骤：

1. 将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟，

2. 进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释。

3. 稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200pfu/ml.

4. 各连续稀释度血清分别与200pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）。

5. 吸出各细胞培养孔中维持液。

6. 接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ，每稀释度两孔，100ul/孔。37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次。

7. 加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养7—9天。

8. 加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2 孵箱培养2——5天，从第二天开始观察空斑数。

9. 抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度。

10. 型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒 （或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时，则不好分型。不足4倍时亦不能定型。

配方：

第一层琼脂糖覆盖液：

2×Eagle MEM液 50ml(Gibco-BRL)

灭活胎牛血清 10ml

L-谷氨酰胺 4ml（200mmol/L,100X）

MEM非必需氨基酸 1ml(Gibco,100x)

1mol/L HEPES缓冲液 2ml

青链霉素 1ml(青霉素10000u/ml,链霉素10000ug/ml)

制霉菌素（一般可以不加） 0.1ml

临用前配制，放入42℃水浴中，另取

琼脂糖 0.6g(Sigma, Type II medium EEO)

超纯水 34ml(适用于细胞培养的纯化水)

8磅高压灭菌15min，置42 ℃水浴15min，加入上述配制的组分中，即可使用；

第二层琼脂糖覆盖液：基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5ml，另加中性红溶液1ml(333.0ug/L中性红钠盐Gibco) 。