中华人民共和国卫生部8月19日，全国登革热监测方案（试行）

附件4 C 6/36（或BHK21）细胞分离登革热病毒

标本：

（1）患者血清：无菌采集发病后5日内登革患者静脉血3ml，分离血清，接种细胞培养；不能及时接种细胞者可置-70℃保存。污染的血清要加双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/ml），4℃2小时处理后接种细胞。

（2）尸检材料：脑、肝等。

（3）蚊：采集吸过血的伊蚊或其它可疑媒介蚊，用0.5mol/L（10％）葡萄糖液喂养，至胃血完全消化后置-70℃保存，死后按蚊种及捕获地点分组，5～10只/组，生理盐水冲洗数次后，用研磨器研碎，每组加0.5ml Hank’s液，2000转/分钟离心15分钟，取上清加双抗（青霉素、链霉素，终浓度各1000U/ml），4℃过夜，备用。

病毒分离：

将培养好的单层细胞上清弃掉，用Hank’s液洗涤2遍，接种用Hank’s液稀释成10-1的患者血清0.1ml或组织悬液或蚊悬液0.2ml。C6/36细胞在28℃吸附1小时， BHK21细胞在37℃吸附1小时，补加维持液，C6/36细胞在28℃培养，BHK21细胞在37℃培养。第二天开始观察细胞病变情况。一般BHK21细胞4天左右出现病变，C6/36细胞需要在28℃培养7天。如果没有细胞病变，则盲传3代（每次取细胞悬液0.1ml）接种细胞传代。按附件6进行鉴定。