中华人民共和国卫生部8月19日，全国登革热监测方案（试行）

附件3 IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体

试验材料：

（1）抗原：

阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。

阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。

（2）抗人IgM（μ链）单克隆抗体或多克隆抗体；

（3）登革病毒IgM阳性、阴性对照血清；

（4）辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；

（5）缓冲液：

洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）；

稀释液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；

封闭液：pH9.6 碳酸缓冲液（1％牛血清白蛋白）；

（6）显色液：A/B液

（7）终止液：4N H2SO4

（8）酶标板、酶标仪。

检测步骤：

（1）用稀释液按效价稀释抗人μ链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过夜；

（2）弃去抗人μ链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；

（3）弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。

（4）将待检血清用稀释液从1：10开始作2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100μl/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；

（5）弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，100μl/孔，4℃过夜；

（6）弃抗原，用洗涤液重复洗3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加4个型混合的酶标单克隆抗体，100μl/孔，37℃水浴2小时；

（7）弃去标记物，用洗涤液重复洗3次，甩干，于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；

（8）加终止液于每反应孔，一滴/孔。

结果判断：

（1）目测方法：

阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。

（2）酶联免疫检测仪检测：

于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）

意义：

阳性结果，表明患者新近DV感染，用于登革热早期诊断。